NCIS海军犯罪调查机构是一部关于一支特工小组的动作剧集，这支小组隶属五角大楼的特别部门，肩负着调查任何有一丝证据证明与海军及海军陆战队人员有关的犯罪，且不论其级别或职位的高低。领导这支小组并独立于海军指挥系统的是NCIS特工Leroy Jethro Gibbs Mark Harmon饰，这名经验丰富的调查员与审问员是个机智、强硬并且为了完成任务愿意打破常规的人。直接受Gibbs领导的是Anthony DiNozzo特工 Michael Weatherly饰，作为一名前重案组探员，其出色的本能来自于大量的调查经验。之后加入他们俩的是Kate Todd Sasha Alexander饰，一个美丽而又坚强的前特勤处特工，曾与Gibbs短兵相接（见NCIS第一季第一集）。还有从事技术分析工作的Abby Sciuto Pauley Perrette饰，是一名天才科学家，她那黑色幽默与哥特风格的装扮相得益彰。新加入小队的是Timothy McGee Sean Murray饰，麻省理工学院（MIT，剧中经常会提到）的毕业生，他对电脑的精通使他在Gibbs率领的小组中成为一名见习特工。在小组背后默默支持的是法医Donald Ducky Mallard David McCallum饰，他见多识广。从谋杀、间谍活动到恐怖活动、盗窃潜艇，这些特工们为了调查所有与海军及海军陆战队相关的犯罪活动，足迹遍布全世界。
