铁面御史剧情由傅侍郎命案、铜镜催杀案、匠人失踪案、桂树夺命案、少女溺水案、四指疑案、倩女离魂案、盐官奇死案、墨水镇劫杀案、恶虎口惊马案等10个案子串连而成。最后，周新与纪纲矛盾激发后，明成祖朱棣听信纪纲馋言，周新被误杀。最终朱棣醒悟过来，将贪腐之臣纪纲处以极刑，并追封周新为杭州城隍，至今已六百年。
铁面御史剧情讲述明朝永乐年间浙江按察使周新查凶审案、惩恶扬善的传奇故事。周新受明成祖朱棣委派，再次赴浙江缉凶查案，平息民怨，破解被无能官员误断误判的案件，拨乱反正，惩恶扬善，严惩贪官污吏，正义得以张扬。剧本结构上设置精妙，全剧双线贯穿，由一个大案及九个悬案串联，人物命运生死交替，变幻莫测，情节环环相扣。
礼部右侍郎傅玉堂到杭州巡查，死在一个暧昧的场所，明成祖朱棣着令杭州府彻查此事。谁知杭州知府和通判因查此案或死或病，无人敢接手，惊报京城，纪纲提议让周新去查案，朱棣下旨，周新奉命再至杭城。周新发觉傅侍郎案疑云重重，查案中他找寻到此案中关键人物傅侍郎书童--小扣子，二人几番受挫，几陷危境，所幸思琪相救得以脱险。京城又来圣旨，让周新再任浙江按察使，不查清案子不得返京。周新带着书童小扣子到浙江任职，他感到背后似有黑手操纵，压力很大。但他仍坚守职责，尽力缉凶办案，维护一方。
铁面御史剧照
周新、思琪、小扣子、张万、李顺等一行人对傅侍郎一案继续深查，一些重要线索渐渐浮出水面，却又很快断了，案子的后面似乎潜藏着京城某个大人物。周新等人对其他案子也尽心查办，陆续破获“铜镜杀人案”、“匠人失踪案”、“桂树夺命案”、“少女溺水案”、“四指疑案”、“倩女离魂案”等多个案子，蒙冤者得以伸冤，无辜者得以释放，凶犯判罪入狱，对无能缺德的地方官员予以严惩，受到浙江及杭城百姓的热情拥戴与支持。
锦衣卫指挥使纪纲是明成祖朱棣的宠臣，一向视周新为对手。傅侍郎一案是他一手策划的一个大的圈套，以此案将周新发至杭州任职，处心积虑的要让周新陷入绝境，以期向他屈服。周新不知是计，赴杭州彻查。不想竟将傅案的内情一一查明，且又在查办“盐官奇死案”一案中，追根寻源，深挖细探，再次触及贪官身后隐藏着的更大贪赃枉法者纪纲。处于被动境地的纪纲再施黑手，制造“墨水镇劫杀案”，借倭寇潜入内地劫杀富户一案，引周新入其圈套，周新中计误判，导致无辜者身陷诏狱，惨遭毒杀。周新不肯屈服于纪纲，誓与其对抗到底，纪纲施狠招再次陷害周新，并嫁祸于周新，激怒了朱棣，下令将周新打入死牢诏狱，纪纲在诏狱痛下杀手，不肯屈服的周新含冤而死，临死时大呼“生为直臣，死为直鬼!”。
三年后，纪纲阴谋叛乱，朱棣这才憣然猛醒，除掉纪纲这个奸贼，并恢复周新名誉，下旨周新为杭州城隍，永世护佑杭城百姓。至今六百年来，杭州吴山上城隍阁香火鼎盛，周新一直受到百姓的爱戴与敬仰。
